斑马鱼显微注射标准操作规范
1、设备与材料准备
使用微玻管拉针器将1.0mm 外径玻璃毛细管拉成针头，存于培养皿中的硅脂坡上。
用微量加载器将3μL 注射物质从针头尾部加载，摇动使气泡尽量减少。
打开气源和显微注射器，将针头插入显微注射器，确保连接紧密。
将胚胎立即排齐在平皿中的衬片上，务必使胚胎单层排列，确保注射时操作简便、快捷。
调整显微镜的照明，以便能清晰地观察到胚胎的细胞结构。
2、注射操作
在显微镜下将针头尖端置于视野平面，用镊子夹住针尖合适位置，使其既能刺穿卵膜和卵黄又能保证注射体积一致。可通过矿物油上的液滴计算单次注射体积，一般注射体积为500pL 或 1nL。
确保胚胎处于适合的发育阶段，如在心玻璃（Heart of Glass，Heg）基因研究中，注射吗啉诺的胚胎应在特定发育阶段，以观察后续心脏发育情况。操作过程中，动作要轻柔，避免损伤胚胎。
3、注射后处理
注射完成后，将胚胎转移到新的培养皿中，保持适宜的培养条件，定期观察胚胎的发育情况，记录注射后胚胎的存活率、发育异常情况等，评估注射操作对胚胎的影响。
斑马鱼感染毒力检定系统标准操作规范
1、感染模型建立
尾静脉注射法：将斑马鱼胚胎麻醉后，使用显微注射技术将细菌悬液注入胚胎尾静脉，注射体积一般为2nL 左右。注射后，将胚胎放入培养皿中，在适宜温度下培养，观察胚胎的存活情况和感染症状。
浸泡感染法：将胚胎浸泡于含有细菌的溶液中，使细菌通过受损的皮肤或鳃进入胚胎体内，从而引发感染。如在研究铜绿假单胞菌的毒力时，可采用尾部受伤的胚胎浸泡于细菌悬液中，然后观察胚胎的存活率和感染情况。
2、毒力评价指标
死亡率统计：在感染后不同时间点，统计感染组和对照组胚胎的死亡情况，以死亡率作为衡量病原体毒力的重要指标之一。通常选择多个时间点进行观察，如感染后24 小时、48 小时、72 小时等，记录胚胎的死亡数量，计算死亡率。
亚致死症状观察：除了死亡率外，还需观察记录胚胎在感染后的亚致死症状，如水肿、运动异常、畸形等。这些症状的出现时间和严重程度也可为研究病原体的致病机制提供更全面的信息。
3、实验条件控制
温度控制：斑马鱼胚胎一般在28℃左右的环境下培养，此温度有利于胚胎的正常发育和细菌的生长繁殖。培养过程中，要保持温度的稳定，避免温度波动对实验结果的影响。
细菌浓度控制：根据实验目的和病原体的特点，选择合适的细菌浓度进行感染实验。浓度过高可能导致胚胎在短时间内全部死亡，无法观察到感染过程中的动态变化；浓度过低则可能无法引发明显的感染症状，影响毒力评价的准确性。
4、数据记录与分析
详细记录实验过程：包括感染时间、细菌浓度、胚胎的发育阶段、死亡时间、亚致死症状出现的时间和程度等信息。这些数据将为后续的分析提供基础。
数据统计与分析：采用适当的统计方法对实验数据进行分析，如卡方检验用于比较不同组之间的死亡率差异，t 检验用于分析感染时间、细菌浓度等与死亡率或亚致死症状之间的关系。
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